外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)是ELISpot和FluoroSpot 分析中最-常-用的細(xì)胞。PBMCs主要包括兩大類細(xì)胞，淋巴細(xì)胞（Lymphocyte）和單核細(xì)胞（Monocyte），其中淋巴細(xì)胞又包括T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。高質(zhì)量的PBMCs是完成ELISpot和FluoroSpot檢測的基礎(chǔ)。具有多年ELISpot和FluoroSpot 檢測經(jīng)驗(yàn)的Mabtech帶您詳細(xì)了解PBMCs分離、凍存和復(fù)蘇全過程，幫助您獲得高質(zhì)量的PBMCs。

一.PBMCs分離

對于全血采集，市場上有多種不同抗凝劑的血液采集管。根據(jù)Mabtech的經(jīng)驗(yàn)，檸檬酸鹽和肝素抗凝劑的血液采集管最-適-合ELISpot。 如果需要大量細(xì)胞，PBMCs也可以從除去血漿和大部分紅細(xì)胞后獲得的白細(xì)胞濃縮物即白膜層中來制備。

材料：全血樣本、無菌Ficoll-Paque分離液、無菌PBS或無血清培養(yǎng)基(例如，RPMI 1640)、無菌15mL和50mL聚丙烯離心管、移液器、無菌巴斯德移液管、無菌吸頭、室溫離心機(jī)

注意：正式開始之前確保所有試劑都恢復(fù)到室溫，保證在無菌條件下操作。

步驟：

1.全血用PBS稀釋2倍(例如，10ml全血+ 10ml PBS)。如果樣本是血沉棕黃層，與全血相比，血沉棕黃層中的細(xì)胞密度更大，因此應(yīng)該稀釋更多倍數(shù)(大約3倍)。

2.準(zhǔn)備含有Ficoll-Paque分離液的離心管。根據(jù)血容量，可以使用15ml或50ml的離心管。如果使用15ml離心管，向離心管中加入5ml Ficoll-Paque。如果使用50ml離心管，則向離心管中加入15ml Ficoll-Paque分離液。

欣博盛常備可代替Ficoll-Paque分離液的Lymphoprep分離液，以及除了分離細(xì)胞外還可分離細(xì)胞器，病毒等的OptiPrep分離液。

3.輕輕地將稀釋的血液加入到Ficoll-Paque分離液的頂部，確保不要擾亂分離液的分層界面。對于15ml的離心管，加入8ml稀釋的血液，對于50ml的離心管，加入25ml稀釋的血液。請注意:加入稀釋的血液時(shí)可以傾斜試管，將血液樣本沿著離心管壁加入。

4.在室溫下以緩升緩降的方式用400 x g的速度離心30分鐘。

5.離心后，用巴斯德移液管小心收集在Ficoll-Paque分離液上層中的由單核細(xì)胞組成的白灰色層，并轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

6.以400 x g的速度離心10分鐘以清洗離心管中細(xì)胞。

7.倒掉上清液，重懸沉淀，并加入PBS或無血清培養(yǎng)基。請注意：重懸細(xì)胞時(shí)，首先輕敲試管，使細(xì)胞沉淀變得松散一些。然后加入1-2 ml緩沖液或培養(yǎng)基，輕柔上下吹打。

8.以400 x g的速度離心10分鐘清洗離心管中細(xì)胞。

9.倒掉上清液，重懸沉淀，并加入無血清培養(yǎng)基。

10.記錄體積，吸取小份進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

11.以400 x g的速度離心10分鐘以清洗離心管中細(xì)胞。

請注意：用Ficoll-Paque分離后，可能存在污染的紅細(xì)胞(RBC)和粒細(xì)胞。如有必要，可以用商業(yè)化紅細(xì)胞裂解液和粒細(xì)胞耗竭試劑清除。

12.如果需要立即使用這些細(xì)胞，則倒掉上清液，輕輕上下吹打，將細(xì)胞重懸在適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基中。PBMCs現(xiàn)在可用于基于細(xì)胞的免疫檢測，例如ELISpot、FluoroSpot 和流式細(xì)胞術(shù)。

如果您需要凍存細(xì)胞，請繼續(xù)參考第二個(gè)部分—PBMCs凍存

圖1. PBMCs分離示意圖

二、PBMCs凍存

材料：細(xì)胞凍存培養(yǎng)基:RPMI 1640(含2mM L-谷氨酰胺)+ 20% FCS和10% DMSO（如果您的細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基，請使用7% DMSO）；1.8ml細(xì)胞凍存管；無菌15mL和50mL聚丙烯離心管；凍存盒，例如“CoolCell"或“Mr. Frosty"；移液器；無菌吸頭；-80℃冰箱；液氮凍存罐。

請注意：操作之前請將凍存管標(biāo)記好，并確保準(zhǔn)備好凍存盒。室溫條件下細(xì)胞在凍存培養(yǎng)基中放置太久會(huì)影響細(xì)胞的活力。

步驟：

1.去除上清(上一節(jié)的步驟11 ),并在凍存培養(yǎng)基中將細(xì)胞稀釋至500萬至2500萬個(gè)細(xì)胞/ml的濃度。如果使用的是無血清冷凍培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度到100萬個(gè)細(xì)胞/ml。

2.在每個(gè)凍存管中加入等體積細(xì)胞懸液，例如每管加入1 ml，并將凍存管轉(zhuǎn)移到凍存盒中。

請注意：對于1.8ml凍存管，建議加入1ml細(xì)胞懸液。對于其他尺寸的凍存管，確保加入體積小于最大體積，因?yàn)橐后w在冷凍過程中會(huì)膨脹。

3.迅速將凍存盒放入-80℃的冰箱中，至少儲(chǔ)存4小時(shí)，最多儲(chǔ)存1周。

4.將凍存管從凍存盒轉(zhuǎn)移到-150℃冰箱或液氮罐中，長期保存。

圖2. PBMCs凍存示意圖

三．PBMCs復(fù)蘇

材料：細(xì)胞培養(yǎng)基:RPMI 1640(含2mM L-谷氨酰胺)+ 10% FCS，10 mM HEPES和100 μg/ml青霉素+ 100μg/ml鏈霉素；無菌15mL和50mL聚丙烯離心管；移液器；無菌吸頭；離心機(jī)；水浴鍋；細(xì)胞培養(yǎng)箱

步驟：

1.準(zhǔn)備工作：將水浴鍋加熱至37 ℃ ，預(yù)熱細(xì)胞培養(yǎng)基，并將洗滌細(xì)胞步驟中使用的緩沖液恢復(fù)到室溫。

2.迅速將凍存管從液氮罐或冰箱轉(zhuǎn)移到37℃水浴鍋中，解凍細(xì)胞，直到只剩下一小塊冰晶。

請注意:如果您打算解凍多個(gè)凍存管，最好每次只解凍幾個(gè)。凍存培養(yǎng)基中含有對細(xì)胞有毒的DMSO，因此需要盡快進(jìn)行下面步驟。

3.向凍存管中緩慢加入0.5-1 ml預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)基，在凍存管中重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中。用1ml細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗凍存管，并將其也轉(zhuǎn)移到15ml離心管中。再補(bǔ)充合適體積的細(xì)胞培養(yǎng)基到離心管中。

4.以300 x g的速度離心10分鐘清洗細(xì)胞。

5.倒掉上清液，輕敲離心管，使沉淀變得松散。通過緩慢加入細(xì)胞培養(yǎng)基，將細(xì)胞重新懸浮在1 ml細(xì)胞培養(yǎng)基中。再加入細(xì)胞培養(yǎng)基至總體積15ml。

6.以300 x g的速度離心10分鐘清洗細(xì)胞。

7.倒掉上清液，將細(xì)胞重懸于1 ml細(xì)胞培養(yǎng)基中。再根據(jù)預(yù)期的細(xì)胞數(shù)量和所需的細(xì)胞濃度添加適量的細(xì)胞培養(yǎng)基。

8.將細(xì)胞靜置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中一小時(shí)。將蓋子稍微擰松一些，便于氣體交換。

9.細(xì)胞靜置完成后，重新懸浮細(xì)胞，再靜置1分鐘讓聚集的細(xì)胞碎片沉淀。然后小心地將無碎片的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的15 ml離心管中。

請注意：每個(gè)15ml離心管中最多加入兩個(gè)凍存管(大約3000-4000萬個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞。

10.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并測定細(xì)胞活力?？梢允褂米詣?dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或使用臺(tái)盼藍(lán)染色顯微鏡觀察來進(jìn)行計(jì)數(shù)。因?yàn)橹挥谢罴?xì)胞才能夠分泌靶標(biāo)分析物，所以確保從細(xì)胞計(jì)數(shù)中排除死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。如果細(xì)胞濃度低于要求，再次離心細(xì)胞，重懸細(xì)胞并稀釋至所需體積。

圖3. PBMCs復(fù)蘇示意圖

溫馨提示：本文中的實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考，實(shí)驗(yàn)時(shí)請按照產(chǎn)品說明書操作。

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